تبلیغات

کد دعای فرج برای وبلاگ

همه چیز درباره ی میکروبیولوژی - تاریخچه و روش کشت سلول
میکرو بیولوژی و زندگی

آغاز کشت سلول یا کشت بافت به قرن نوزدهم زمانی که بررسی روی جزئیات بافت و اعضای ارگانهای بدن در ظرف شیشه ای آغاز شده بود، برمی گردد. در سال1885 شخصی به نام رکس توانست تا مدتی سلولهای جنین جوجه را در سرم فیزیولوژی نگهداری کند که البته نمی توان کشت سلول نامید. در اواخر قرن نوزده روشهایی به منظور نگهداری اسپرم به صورت منجمد جهت تلقیح مصنوعی چهارپایان ارائه گردید. در سال1907 هریسون برای اولین بار توانست فیبرعصبی جنین قورباغه را در ظرف حاوی لنف قورباغه نگهداری کرده و نشان دهد که اگزونهای فیبر عصبی منشعب می گردند. در سال 1912 کارل توانست سلولهای بافت پیوندی را به مدت طولانی کشت دهد. در سال 1948 سانفورد و همکارانش اولین کلون سلول L را تهیه نمودند. در سال 1952 گی و همکارانش از سرطان رحم، اولین لاین سلول انسانی به نام هلا را بدست آوردند. در سال 1954 هیسمن و ابرکرومبی پدیده ممانعت تماسی بین سلولهای فیبروبلاست را تشریح کردند. در سال 1955 ایگل و بعدها دیگران قادر شدند محیطهای کشت مناسب، فاکتورهای اتصال و لایه تغذیه کننده برای سلول را شناسایی کنند. در سال 1961 مورهد و هی فلیک عمر فناناپذیر سلولهای دیپلوئید انسانی را شرح دادند. در سال 1962 بوناسیسی و همکارانش روشهایی برای نگهداری سلولهای مشتق از منشأ توموری ارائه دادند. در سال 1968 یافته تمایز میوبلاستهای طبیعی را در شرایط آزمایشگاه(in vitro) مطالعه کرد.
در دهه 70 روشهای رشد سلولهای خاص در محیطی حاوی ترکیبات شیمیای ارائه گردید و گاردونساتو و همکارانش احتیاجات سلول به فاکتور رشد پروتئینی، فاکتورهای اتصال نظیر گلیکوپروتئینهای با وزن مولکولی بالا در ماتریکس خارج سلول و هورمونهایی نظیر انسولین و فاکتورهای رشد شبه انسولینی را تشریح کردند. در سال 1979ساتو و بوتون استین ترکیبات محیط کشت بدون سرم برای سلول عصبی را مشخص نمودند. و بعدها تحقیقات زیادی با استفاده از کشت سلول گسترش یافت.
روشهای کشت سلولی علم سابقه داری است که از آغاز قرن اخیر تاکنون با سرعت قابل توجهی راه توسعه و ترویج را پیموده است طوریکه امروزه به ابزاری ضروری در تحقیقات ،بویژه در علوم زیست شناسی ملکولی ویروس شناسی ایمنی شناسی مهندس ژنتیک و بیولوژی تبدیل شده است . نیاز به علم کشت سلول درآینده محسوس تر خواهد شد زیرا اقتصاد کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه در آینده نزدیک وابسته به پیشرفت علم بیوتکنولوژی و در خاتمه این قرن وابسته به کاربرد فرآورده های بیولوژیک می گردد.

پژوهشکده شمال کشور انستیتو پاستور ایران به مرکزیت شهرستان آمل همانند جامعه علمی درکشورازاین پیشرفت غافل نبوده ونیازبه این فن را احساس کرده است لذا بکار گیری تکنیک کشت سلول در روشهای پاسخگوئی تشخیصی بیماری اولین باردر واحد هاری این مرکز بکار گرفته شد. درهمین راستاچهارکارشناس این بخش که قبلاَ دوره های تخصصی تشخیص ایمنو فلورسانس را گذرانیده بوده اند با اعزام به آزمایشگاه رفرانس هاری WHO درانستیتو پاستور ایران و طی کردن دوره های مقدماتی و تخصصی ویژه روش کشت سلولی با تکنیکهای ظریف و دقیق کشت آشنا و آماده پاسخگویی بصورت پارالل ( همزمان ) با روش سنتی ( تزریق به حیوانات آزمایشگاهی ) بوده این امر بمدت دو سال ادامه داشته تا اینکه جایگزین تهیه لام و پاساژ به حیوان گردد.

درمورد کشت سلولی وراه اندازی این واحد مهم همانقدر باید گفت که با این روش دریچه ای بسوی مراحل مختلف بیماری یابی و تشخیصی وراهکارهای مبارزه با این نوع بیماری سرعت بیشتری به خود می گیرد ودست محققین این مرکز جهت تشخیص انواع سوشهای ویروس هاری در 5 استان متذکر شده باز ومیتوان یاد آوری کرد که روشهای کشت سلولی وکاربرد آن دربخش هاری میانبری جهت پاسخ صحیح وسریع درمورد این بیماری می باشد .


روش کشت:

از آنجا که گروه های مختلف باکتری ها نیازهای غذایی متفاوتی دارند محیط های کشت متفاوتی طراحی شده اند همه موجودات زنده به یک منبع انرژی یک منبع کربن، نیتروژن، گوگرد، فسفات، چندین یون متابولیکی و آب احتیاج دارند. آنهایی که منبع کربنشان از مواد آلی است در گروه هتروتروف قرار می گیرند و آنهایی که می توانند مستقیماً از دی اکسید کربن موجود در هوا استفاده کنند اتوتروف نامیده می شوند همه باکتریها انرژی خود را از طریق فتوسنتر و یا اکسید اسیون شیمیایی به دست می آورند.
باکتریها معمولاً در محیط کشت تعریف شده شیمیایی و در درون لوله آزمایش و یا پتری کشت داده می شوند برای استحکام بخشیدن به محیط کشت از آگار استفاده می شود. وقتی یک سلول درون محیط کشت درون یک پلیت قرار داده شود شروع به تقسیم می کند پس از آنکه باسیون یک کلونی خواهیم داشت در حالی که قبلاً یک سلول وجود داشته است.
همپوشانی کلونی ها ناشی از رشد متقاطع کلونی ها در شکل زیر نمایش داده شده است
شکل زیر
img/daneshnameh_up/f/f2/bioM0105.jpg
محیط کشتی که حاوی مینیمم احتیاجات غذای لازم برای رشد باکتری باشد محیط کشت کمینه (minimal medium)خوانده می شود
جدول زیر
img/daneshnameh_up/5/54/bioMj0050.gif
باکتریها می توانند در محیطی علاوه بر کمینه نیازها حاوی مواد پیچیده تر که باکتری به طور عادی سنتز می کند رشد کنند این مواد شامل اسیدهای آمینه، ویتامین و ... غیره می باشد یک محیط کشت از این نوع به گونه هایی از باکتری اجازه رشد می دهد که به آن ها auxotrophsگویند که نیازهای غذایی پیچیده تری دارند. به گونه وحشی پروتوتروف گفته می شود. برای مثال گونه ای که دارای نقص آنزیمی در مسیر تولید آمینو اسید هیستیدین می باشد در محیط کشت کمینه رشد نخواهد کرد زیرا راهی برای بدست آوردن هیستیدین ندارد هر چند اگر هیستیدین به محیط افزوده شود باکتری می تواند رشد کند به این نوع جهش Conditional_lethal mutantگفته می شود. باکتری در شرایط معمول می میرد ولی تحت شرایط مناسب مثلاً حضور هیستیدین می تواند زنده بماند.
این باکتری جهش یافته محتاج به هیستیدین فقط در محیط غنی شده می تواند رشد کند به این محیط enrieched mediumگویند. با وجود این گونه وحشی پروتوتروف می تواند در محیط کمینه رشد کند.
محیط های کشت معمولاً بوسیله افزودن مخلوطی پیچیده از مواد آلی از قبیل خون، عصاره گوشت و عصاره مخمر غنی می شود. بسیاری از محیط های کشت با افزودن فقط یک ماده دیگر مانند اسید آمینه و یا ویتامین ساخته می شود. به این محیط کشت محیط کشت انتخابی گفته می شود که موارد استفاده آن بعداً در همین فصل توضیح داده خواهد شد. علاوه بر محیط های کمینه، غنی شده و انتخابی محیط کشت های دیگری برای مقاصد خاصی از قبیل شمارش کلونی ها، نگاه داشتن باکتری ها در فاز ثابت و غیره مورد استفاده قرار می گیرند.
کشت عملی ویروس ها متفاوت از باکتری ها است چون ویروس ها انگل اجباری هستند فقط می توانند درون سلولهای زنده رشد کنند پس برای کشت باکتریوفاژ پلیت های حاوی محیط کشت مناسب به همراه مقدار کافی باکتری به کار برده می شود باکتری ها در این محیط تشکیل یک پوش پیوسته bacterial lawnرا می دهند. این محیط باکتریایی به عنوان محیطی برای رشد ویروس های اضافه شده به محیط استفاده می شود. چون حمله ویروس به باکتری نهایتاً منجر به پارگی و در نتیجه لیز سلول باکتری می شود اضافه کردن ویروس منجر به ایجاد لک های واضح بر روی پلیت می شود که به آن plaquesگویند. برای تعیین مشخصات رشد گونه های ویروس مختلف مورد مطالعه می توان از گونه های مختلف باکتری در محیط کشت استفاده نمودار شکل زیر
img/daneshnameh_up/0/02/bioM0106.jpg